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重癥肌無力抗體的測(cè)定步驟如下
更新時(shí)間:2022-01-21   點(diǎn)擊次數(shù):767次
  重癥肌無力(myastheniagravis,MG)是一種T細(xì)胞依賴的乙酰膽堿受體抗體(AChR-Ab)介導(dǎo)的自身免疫性神經(jīng)肌肉接頭處的疾病。MG的基本病理機(jī)制是AChR-Ab介導(dǎo)的神經(jīng)肌接頭終板突觸后膜上乙酰膽堿受體(AChR)數(shù)量的減少。乙酰膽堿受體抗體是MG主要的自身抗體,由自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞激活體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。FcyRIIB是細(xì)胞表面免疫球蛋白IgG的Fc段受體之一,是一個(gè)能與IgG的Fc段低親和力結(jié)合的抑制性受體,也是表達(dá)于B淋巴細(xì)胞表面的免疫球蛋白受體,在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中具有重要作用。
  重癥肌無力抗體的測(cè)定步驟如下:
  1.抗原包被:用PH值9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液將純化的AChR以0.5ug/ml的濃度進(jìn)行稀釋,按每孔0.1ml小心加入酶標(biāo)板各孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。然后用封板膜封好反應(yīng)孔,放在4℃冰箱中12小時(shí)過夜。
  2.洗滌:倒盡板孔中液體,吸干孔內(nèi)殘余反應(yīng)液,空干,加滿洗滌液晃動(dòng)2min,倒去,反復(fù)4次,將反應(yīng)板倒置在吸水紙上,拍干。
  3.封閉:在各反應(yīng)孔中加滿含2%牛血清蛋白的PH值7.4/0.01M的PBS,室溫下孵育30min。
  4.加血清:按上述方法再洗滌4次后,在各反應(yīng)孔中加入用0.01M,PH值為7.4的PBS-Tween20稀釋100倍的MG患者的血清0.1ml,每份標(biāo)本做兩孔檢測(cè),留2孔為空白對(duì)照。用封板膜封好各反應(yīng)孔,37℃水浴90min。
  5.加HRP-羊抗人IgG抗體:按上述方法洗滌4次后,在各反應(yīng)孔中加入用0.01M,PH值為7.4的PBS-Tween20稀釋1000倍的HRP-羊抗人IgG抗體0.1ml,用封板膜封好各反應(yīng)孔,37℃水浴90min。
  6.加底物:按上述方法洗滌4次,在各反應(yīng)孔中加入顯色劑A液和顯色劑B液各70ul,用封板膜封好各反應(yīng)孔。避光顯色10min。
  7.加終止液:在各反應(yīng)孔中加入終止液50ul,終止顯色反應(yīng)。
  8.結(jié)果判讀:根據(jù)有無顯色反應(yīng)判定結(jié)果的陰、陽性。
  9.終止顯色反應(yīng)30min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取450mm/630mm的OD值。將MG患者的OD值減去空白對(duì)照的OD值即為結(jié)果,每份血清的結(jié)果為兩孔平均值。該結(jié)果與血清中抗AChR-lgG水平為半對(duì)數(shù)關(guān)系,OD值越高則血清中抗AChR-IgG的水平越高。
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